壹、前言 高病原性家禽流行性感冒（Highly pathogenic avian influenza ，以下 簡稱HPAI）過去稱為「雞瘟」，是由正黏液病毒科（Orthomyxoviridae） 之A型流行性感冒病毒感染所引起。A型流行性感冒病毒是唯一會自然感染 禽鳥類的正黏液病毒。許多禽鳥類對家禽流行性感冒（以下簡稱為AI）病 毒具有感受性。水禽為保毒宿主，而水禽帶原病毒對雞及火雞大多為低病 原性。病毒之核蛋白衣（Nucleocapsid，以下簡稱為NP）和基質蛋白（M- atrix proteins，以下簡稱為MP）為流行性感冒病毒型別相關抗原，血球 凝集素（Hemagglutinin，以下簡稱H）及神經胺酸?（ Neuraminidase， 以下簡稱N）為亞型（Subtypes）分類抗原。目前有16種H亞型（ H1～H16 ）及9種N亞型（N1～N9）。只有H5和H 7兩 種亞型病毒會對雞、火雞及其 他經濟類禽鳥造成HPAI臨床症狀。大部分H5和H7亞型病毒對家禽為低毒力 。H5 或H7病毒都可能突變成高毒力，因此，世界動物衛生組織（OIE）規 範所有H5和H7病毒為須通報的家禽流行性感冒（Notifiable avian infl- uenza；NAI）。 HPAI感染會依禽鳥的品種及年齡、病毒株的特性及環境因子，而呈現不同 的臨床症狀。高感受性鳥類可能呈現無臨床症狀而猝死或呈現不一嚴重度 之臨床症狀，例如結膜炎、鼻炎、咳嗽、噴嚏、呼吸困難、顏面腫脹、沉 鬱、警覺性降低、顯著減少飲水及攝食、雞冠、肉垂及腳鱗皮膚發紺、神 經症狀及下痢等。產蛋雞會有明顯的產蛋量下降，品質不良蛋增加。典型 的HPAI常呈現高發病率及急速上升之死亡率。低病原性家禽流行性感冒（ Low pathogenic avian influenza，以下簡稱LPAI）通常只造成輕微或無 臨床症狀，但在某些情況下會產生嚴重的臨床症狀而誤以為是HPAI。 HPAI之確診係依據所分離出病毒之病原性鑑定，但在特殊情況下，可分析 檢體中病毒血球凝集蛋白（以下簡稱為 HA0）切割位之胺基酸序列，以達 到確診的目的。檢測疑患禽鳥的血清抗體可做為輔助診斷，不適合用於確 診。當有疫情發生時，為了防疫需求以儘速控制疾病，診斷可以依分子檢 測結果（例如HA0切割位之胺基酸序列呈現HPAI病毒特徵），加上H亞型檢 測的結果來判定。 病原性的鑑定係以接種無特殊病原（Specific pathogen free，以下簡稱 SPF）或家禽流行性感冒（以下簡稱AI）抗體陰性（Specific antibody negative，以下簡稱SAN）雞隻的靜脈接種致病指數（Intravenous path- ogenicity index，以下簡稱IVPI）或接種雞隻死亡率為其黃金準則。IVPI 大於1.2或接種雞隻死亡率大於75%者判定為HPAI，IVPI低於1.2之H5及H7亞 型須進一步分析其HA0切割位胺基酸序列，若HA0切割位的胺基酸序列與其 他HPAI分離株的序列相似者，須考慮該病毒具有發展成HPAI的潛勢，爰判 定為HPAI。 貳、實驗室檢驗 <p />一、 病毒檢驗 　<br />(一)採取病材 　１、病材採取之品質好壞及其保存與輸送的狀況，密切影響AI病毒之分 　離及診斷結果。採樣以發生臨床症狀三日內所得之病材檢測效果最 　佳。 　２、死禽：死禽採取全身各組織臟器，包括氣管、肺、腸、脾、胰、腎 　、腦、肝及心臟等，病材可分開或混合處理。 ３、活禽：活禽採取喉頭氣管拭子和共泄腔拭子，幼小個體禽類不易採 　集者，則採新鮮排遺取代之。採取之拭子保存於含有抗生素的磷酸 　緩衝液（Phosphate buffer saline；以下簡稱PBS）或含有蛋白質 　及抗生素的輸送培養液內。輸送培養液係由細胞培養液（Minimum 　essential medium；MEM）或PBS 或 tryptose-phosphate broth（ 　TPB）或腦心浸出液（ Brain- heart infusion；BHI）等為基礎液 　，再加0.5～1%牛血清白蛋白或明膠（Gelatin）及抗生素（具有保 護病毒及抑制細菌之效果）。 ４、輸送與保存：採集之病材應馬上以低溫冷藏方式輸送至檢測實驗室 　或存放於 4℃ 最多4天。需長期保存之診斷病材應存放於 -80℃， 　避免重覆解凍。若以乾冰保存或輸送則需將病材密封，以防二氧化 　碳之滲入，致pH值降低而造成病毒不活化。 　<br />(二)病毒分離 　分離AI病毒需用SPF或SAN的雞胚胎蛋為接種材料。 　１、病材處理： (１)喉頭氣管拭子及共泄腔拭子試管以震盪器混合均勻後靜置備用。 (２)組織病材與輸送培養液混合研磨成10%（W/V）乳劑，處理完成之 病材乳劑於室溫中1～2小時內儘速接種完成，若放於 4 ℃ 僅能 保存數天，否則應存放於 -80 ℃ 。 (３)上述(１)(２)經 1,000 g 離心10分鐘，取上清液供接種用。 　２、雞胚胎接種：喉頭氣管拭子、共泄腔拭子或組織乳劑上清液接種於 　9～11日齡SPF或SAN雞胚胎蛋的尿囊腔內。每批病材接種至少5個蛋 　，每個蛋接種0.1～0.2 mL。接種後，將蛋放在35～39 ℃恆溫箱中 　培養2～7天。 　３、收集病毒液：收集病毒液前先將蛋冷卻於 4℃ 4小時或隔夜，待蛋 　內血管收縮後，抽取尿囊液。並以血球凝集試驗進行篩檢，如果沒 　有血球凝集性，該尿囊液應至少再盲目接種一代；如果有血球凝集 　性且無細菌污染，表示可能有 A型流感病毒或禽類副黏液病毒之存 　在，需進一步以瓊膠免疫沉降法（Agar gel precipitation；以下 　簡稱AGP）或反轉錄聚合?鏈反應（Reverse transcriptase-polym- 　erase chain reaction，以下簡稱 RT-PCR）等方法鑑定病毒型別， 　再以血球凝集抑制法、神經胺酸?抑制法或RT-PCR等方法鑑定亞型。 　４、核酸鑑定：使用如RT-PCR、即時反轉錄聚合?鏈反應（Real-time 　 RT-PCR）、反轉錄恆溫環形核酸增幅法（RT-Lamp）等以分子為基 　礎的鑑定技術，配合引子或探針的特異性進行檢驗，或比對基因序 　列，以達鑑定病原之目的（相關操作如參考文獻４～７）。 　<br />(三)以血球凝集抑制法（Hemagglutination inhibition；以下簡稱HI） 　鑑定病原亞型： 　基於AI病毒的H蛋白具有血球凝集（以下簡稱HA）特性，用已知H亞 　型之抗血清進行HI法來鑑定病毒之H亞型。首先需儲備 AI病毒亞型 之標準抗原和抗血清（詳見附錄1），HI法使用之紅血球取自SPF或 　SAN雞隻的血液。HI試驗前需先測定抗原之力價，以定量的 4 HA單 　位抗原來執行HI檢測。 　１、對照抗原和分離株HA力價測定： (１)以96孔微量測定盤進行試驗。 (２)分裝25 L PBS至第2～第12孔（A～H列）。 (３)第1孔（A1～F1）分別加50 L分離株病毒液或對照抗原。G及 H 列的第1孔不加抗原液。 (４)H列作為血球對照用，所以H列第1孔加50 L PBS。 (５)由第1孔開始進行25 L 兩倍連續序列稀釋，稀釋之最後一孔丟 棄25 L。 (６)再加25 L PBS至每一孔。 (７)全盤每孔加25 L之1%雞紅血球懸浮液。 (８)輕拍盤子使混合均勻，在室溫中放置約40分鐘，見血球對照孔之 血球完全沉降下來即可判讀及記錄。 (９)血球與病毒（或抗原）完全凝集記為＋，不完全凝集記為 ＋/－，血球完全沉降者記為 －。將盤子傾斜，觀察血球 淚滴狀流下，流下之速度與血球對照相同者表示血球完全沉降。 完全凝集之病毒（或抗原）最高稀釋倍數，即代表病毒（或抗原 ）之HA力價。 　２、製備HI試驗用標準抗原液及迴歸力價測定： (１)先計算進行HI試驗所需4 HA 單位（4 HAU）抗原液總量後，將已 知力價之病毒（或抗原）以PBS稀釋為4 HAU/25 L 濃度，置於 4℃ 備用，稀釋好的抗原液僅限於當日使用。 (２)製備好的4 HAU抗原液再次進行HA 試驗，迴歸檢測以確定製備之 抗原液力價，檢測結果應在前三孔呈現HA。如果力價不對，HA多 一孔則再將抗原等量稀釋二倍，HA少一孔則需再加入等量的抗原 ，使抗原濃度增加一倍。 　３、血球凝集抑制試驗（鑑定野外株病毒）： (１)分裝25 L PBS至B～H列的第1～12孔。 (２)分別加50 L H1～H15標準抗血清至A排各孔。 (３)由第1孔開始進行25 L 兩倍連續序列稀釋，稀釋之最後一孔丟 棄25 L。 (４)每孔加入25 L 4 HAU病毒或抗原，在室溫感作15分鐘。 (５)每孔再加25 L1%之雞紅血球懸浮液，輕微振盪混勻後，靜置室 溫中約40分鐘，見血球對照孔之血球完全沉降下來即可判讀及記 錄。 (６)可以完全抑制4 HAU抗原的血清最高稀釋倍數即為HI力價。 (７)每一血清均採重複二列之序列稀釋，一列供檢測分離株病毒用， 一列做為陽性抗原對照用。 (８)最後兩列（G及H列）作為紅血球對照用，以PBS 取代血清稀釋及 　抗原添加。 (９)若有抗原與抗體反應，則血球凝集被抑制。同樣將盤子傾斜判讀 ，血球完全凝集記為＋，不完全凝集記為 ＋/－，完全 抑制凝集記為－。完全抑制凝集之最高血清稀釋倍數，即代 表抗體之HI力價。 (１０)假如野外分離株與某一亞型參考血清反應的HI力價大於其他亞 型血清4倍以上，則此力價較高者表示為分離株之亞型。 　<br />(四)病原性鑑定 　病原性的鑑定係以接種雞隻的靜脈致病指數（IVPI）或接種雞隻的 　死亡率為其黃金準則，配合HA0 切割位胺基酸序列分析，以評估病 　毒之病原性。 　１、IVPI： (１)HA力價大於1:16之新鮮病毒液，以滅菌之生理食鹽水稀釋10倍。 (２)取稀釋之病毒液靜脈接種10隻4～8週齡SPF或SAN雞隻，每隻 0.1 mL。 (３)每24小時觀察一次，持續10天，在每次觀察時記錄每隻雞之分數 ：正常雞記0分、發病雞記1分、嚴重發病記2分、死亡雞記3分（ 發病程度之判定通則：出現呼吸症狀、沈鬱、下痢、無毛部皮膚 或肉垂發紺、頭或臉水腫及神經症狀等其中一種症狀時，判為 發病，呈現一種以上症狀時，判為嚴重發病）。死亡之雞 隻在死亡之後每日的觀察值皆要記為3分。 (４)IVPI係指10日觀察期間，每天每隻雞之平均分數。將全部雞隻10 日之總分除以100即為IVPI值。IVPI=3.00表示所有的雞在24小時 內死亡；IVPI=0.00表示在10 日觀察期間沒有雞隻呈現任何臨床 症狀；IVPI值大於1.2者為HPAI。 　２、接種雞隻死亡率檢測： (１)無菌新鮮之病毒尿囊液稀釋10倍。 (２)靜脈接種8隻4～8週齡具感受性雞隻，每隻接種0.2 mL，觀察 10 日。 (３)計算死亡率，當雞隻死亡6、7或8隻時（即死亡率達75%以上）， 則判定為HPAI。 　３、血球凝集蛋白（HA0）切割位胺基酸序列分析： 所有H5或H7病毒株其IVPI小於1.2或接種雞隻死亡率小於75%者，都 　須再進行本方法分析該病毒的HA0 切割位胺基酸序列，若序列與其 　他HPAI分離株相似，則判定為HPAI。 　本法旨在分析H5和H7亞型AI病毒HA0 核酸序列，而推演出對應的胺 　基酸序列。最常使用的方法是RT-PCR，即在切割位兩端序列設互補 　引子（引子序列參見附錄2 ），進行循環序列分析。可依商品化套 　組之建議設定過程中不同的條件，並以自動化序列分析儀分析。 (１)病毒RNA萃取（或依商品化套組之建議操作） 　Ａ、病毒液200 L加入 1 mL核酸萃取液（Trizol），混合均勻後 　，靜置室溫5分鐘。 　Ｂ、加200 L 氯仿（Chloroform），混合後，靜置室溫 3分鐘， 　12,000 rpm離心15分鐘。 　Ｃ、取分離層之上層600 L於另一新試管內，加入 600 L 異丙 　醇（Isopropanol），混合均勻，靜置室溫 10 分鐘， 12,000 　rpm離心20分鐘。 　Ｄ、倒掉上清液，加入75%酒精1 mL，混合後再於12,000 rpm離心5 　分鐘。 　Ｅ、輕輕倒掉上清液，並用微量吸管小心抽掉其餘酒精，靜置數分 　鐘使殘餘之酒精揮發。 　Ｆ、加入100 L含 DEPC（Diethylpyrocarbonate）處理過的蒸餾 水，以微量吸管將病毒RNA溶解均勻。 　Ｇ、待用時置放於 4℃ ，否則保存於 -20℃ 。 (２)cDNA合成（或依商品化套組之建議操作） 　Ａ、取4 L RNA及陰性對照管（管內放水）加0.5 L primer 　Uni-12。 　Ｂ、72℃作用5分鐘後。 　Ｃ、加入預先調配好之cocktail合成反應液，每管5.5 L。 　Ｄ、全量10 L混合均勻，在 42℃ 作用1小時。 　Ｅ、95℃ 5分鐘使RT反應停止。 (３)PCR反應（或依商品化套組之建議操作） 　Ａ、每管取1.5 L cDNA加入48.5 L PCR反應液。 　Ｂ、將試管放在溫度循環器內，設定增幅條件： ◆94℃ 2分鐘 ◆94℃ 1分鐘─────┐ ◆50℃ 1分鐘 │　30個循環 ◆72℃ 3分鐘─────┘ ◆72℃ 8分鐘 ◆4 ℃至使用 (４)PCR產物電泳 　Ａ、將agarose電泳膠放入電泳槽內，倒入1x TBE 緩衝液，蓋過膠 　片。 　Ｂ、取4 L PCR 產物，混以3 L loading buffer。 　Ｃ、加4 L 分子量標示物於電泳膠第一孔。 　Ｄ、取7 L PCR 產物、陽性對照和陰性對照，分別加入電泳膠的 　不同孔中。 　Ｅ、蓋上電泳槽蓋子，設120 V電壓跑30-40分鐘。 　Ｆ、最後在302 nm波長之紫外光下觀察分子標示物及PCR 產物，並 　比較分子量大小。 (５)PCR產物定序 若經電泳分析PCR 產物分子量大小無誤，則取此特異性片段產物 利用自動核酸序列分析儀進行定序反應，核酸序列分析結果以電 腦序列分析軟體自動轉換為胺基酸序列後，讀取檢測毒株之 HA0 切割位胺基酸序列。 (６)判讀 HA0 切割位胺基酸序列如果和已知高病原性病毒之序列相似，即 判定為HPAI。 <p />二、血清學檢測 　<br />(一)酵素連結免疫吸附分析（ Enzyme-Linked Immunosorbent Assay； 　ELISA） 　一般市售商品化 ELISA抗體檢測套組無法檢測AI抗體亞型，只能證 　實有A型流行性感冒的抗體存在，操作依套組使用說明使用。 　<br />(二)以瓊膠免疫沉降法（AGP）檢測抗體： 所有 A型流行性感冒病毒均具有相似的NP及MP抗原，而本法利用抗 　原／抗體在高濃度鹽類之瓊膠內移動擴散產生抗原／抗體沉降線反 　應，檢測血清中有無A型流行性感冒病毒之特異性抗體。 　１、抗原製備：以AI病毒接種10日齡 SPF雞胚胎蛋後，取其絨毛尿囊膜 　研磨成均質化，再經反覆冷凍解凍三次後，以 1,000g 離心10分鐘 　，取上清液添加0.1%福馬林或1% betapropiolactone使病毒不活化 　，再離心一次之上清液即為 AGP抗原使用。以本法製備之抗原主要 　為NP抗原。 　２、瓊脂盤製備：泡製 1%（w/v）agarose（如附錄三之九）或純化的 　agar與 8%（w/v）氯化鈉溶於PBS內，加熱溶解，倒 20 mL至 9 cm 　平皿內，使用孔徑 5 mm孔間距為 2-5 mm的孔型打洞後挖除洞中之 　瓊脂。 　３、方法：每孔加入50 L試劑，每個測試血清緊鄰已知陽性血清和抗 　原，如此才能確定測試血清與NP抗原間產生的沉降線和已知陽性沉 　降線是否連續吻合。加完試劑後，瓊脂盤放入密封容器內，再放入 　一塊濕棉花以保持容器內溼度，放室溫中。 　４、判讀：約 24-48小時後檢查沉降線，在暗視野有背光之下觀察，當 　測試孔與抗原間產生了沉降線，且與陽性對照線連成連續性的吻合 　線則判為特異性陽性。若為交叉線則表示測試血清與陽性對照血清 　的抗體不同，應判為陰性。 　<br />(三)血球凝集抑制（HI）抗體檢測 以AGP或ELISA法檢測為AI抗體陽性之血清，可依需要以HI方法來鑑 　別其是否為H5或H7亞型抗體。其執行方法如前所述，預備H5或H7標 　準株或已知H5或H7野毒株做為本檢測用抗原，檢測結果抗體力價1: 　16或以上判為陽性，抗體力價1:4至1:8為疑陽性，需增加血清樣本 　數加以檢測，並配合其他臨床症狀、肉眼病變及病毒學發現才可以 　下診斷。 參、綜合判定準則 我國自2004年以來家禽場已存在H5N2 LPAI病毒，近年來除了 LPAI病毒外 ，由基因序列演化分析也證實HPAI病毒存在雞群中。在LPAI與HPAI病毒共 同於雞群中存在的現象，增加檢驗及診斷的複雜性與困難度。在此情況下 ，疑患場雞群臨床上不一定會出現HPAI典型的臨床症狀、高發病率及高死 亡率現象，故單以臨床觀察為依據易喪失防疫先機。面臨如此複雜的診斷 案例，為了掌控防疫先機，對於需通報的HPAI及LPAI之診斷判定依據以下 規範辦理： <p />一、高病原性家禽流行性感冒（HPAI）: 參酌世界動物衛生組織（OIE）對於 HPAI之認定依據，符合以下二項 條件之一者即判定為HPAI： 　<br />(一)接種雞隻死亡率大於75%或IVPI大於1.2。 　<br />(二)HA0切割位胺基酸序列相似於其他HPAI病毒株序列（參考附錄4所列 　國際已知HPAI之HA0切割位胺基酸序列及附錄5我國已發生 HPAI 之 　HA0切割位胺基酸序列）。 我國已發生之 H5N2病毒HPAI的HA0切割位胺基酸序列至目前止，包括 -RKKR-及-RRKR-兩種，因此疑患禽場之臨床病材可直接經由核酸檢測 確定H5亞型，經過定序後，若確定 HA0切割位序列為-RKKR-或-RRKR- ，即判定為HPAI。 <p />二、需通報之LPAI： 　 所有非HPAI之H5或H7病毒株皆屬之。臨床病材經病毒分離或核酸檢測 發現為H5或H7亞型病毒或核酸，經 HA0切割位序列分析沒有符合已知 HPAI切割位序列者；（1）當切割位未具有-BXBR-（B表示鹼性胺基酸 R或K）特性之H5或H7亞型，得以切割位結果直接判定為需通報之LPAI （註1）；（2）當切割位具有-BXBR-特性時需再補行IVPI或接種雞隻 死亡率檢測，檢測結果IVPI小於1.2或死亡率小於75%者判定為需通報 之LPAI。但如果此-BXBR-序列與國內往例判定之LPAI的切割位序列相 似時，得直接判定為需通報之LPAI（註2）。 註1：例如野鳥及水禽常見之LPAI病毒株，其HA0切割位序列只有1至2個鹼 性胺基酸，未具-BXBR-特性。 註2：例如H5亞型之-REKR-（3個鹼性胺基酸）。 肆、參考文獻 　１、Australian Standard Diagnostic Techniques for Animal Dise- 　ases. 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