壹、臨床病理檢驗 豬瘟（Hog cholera） 是由濾過性病毒所引起的一種高度傳染性敗血 症，以全身性出血為主徵，感染率與死亡率均高達 95 ％至 100 ％ 。本病一般呈急性病程，但可轉為慢性。在甚急性病例僅見極輕微的 病變或不見病變，而在急性和亞急性病例則可見相當嚴重的病變。 本病最早於西元 1810 年發生於美國田納西州，唯首次確診豬瘟病例 則屬 1833 年發生於美國愛渥華州，當時造成養豬業極大的損失。嗣 後，1862 年傳至歐洲，然後散佈至世界其他各地（19, 24）。豬瘟 雖已普遍發生於世界各地，但由於採行嚴厲的撲殺政策，在澳大利亞 、加拿大、丹麥、芬蘭、英國、冰島、愛爾蘭、紐西蘭、瑞典和美國 等已撲滅豬瘟（42）。 本病在西元 1945 年以前已存在於臺灣地區（4） 。1947 年豬瘟發 生率曾高達 8.13 ％，使養豬業者遭受極大損失。最初，在 1929 年 至 1948 年間曾使用寺門氏福馬林臟器疫苗防疫豬瘟，此種疫苗之安 全性雖高，但免疫效力不理想。1949 年順利製成結晶紫豬瘟疫苗後 ，即試行結晶紫豬瘟疫苗之全面性預防注射計畫，惟結晶紫豬瘟疫苗 因其免疫效力短暫及豬隻移動的頻繁，使豬瘟防疫效果不如預期理想 。自 1958 年全面使用兔化豬瘟活毒疫苗（LPC） 預防控制後，在 1 965 年時豬瘟發生率遂降為 0.02 ％（2） ，但至今仍有零星發生病 例。 豬瘟病毒的自然宿主為豬和野豬，而在其他動物如兔子和天竺鼠亦能 馴化增殖，病毒經馴化後毒力減弱可當疫苗種毒使用（2, 5, 28）。 豬瘟感染豬及其分泌物或排泄物為豬瘟主要傳染源。病毒可經由患畜 之尿液、糞便、淚腺以及鼻腔分泌物而排出體外，因此接觸傳染為豬 瘟傳播之主要途徑。豬瘟雖能感染其他動物，但豬是唯一能產生症狀 者。因此，豬是唯一的自然宿主也是最重要的感染源（32）。 病毒亦能藉生物和無生物媒介傳染，例如污染衣物、鞋類、狗、貓、 鳥、節肢動物、虻蠅、蚊蟲、旋毛幼蟲、載運車輛、板箱以及各項器 具而機械性地傳染（23, 36, 41, 43, 49）。 在密集養豬國家，經採用各項防疫措施控制豬瘟後，豬瘟臨床和病理 特徵可能改變。除一般急性型豬瘟外，尚有慢性和非典型豬瘟的發生 ，亦常見輕微或不顯性豬瘟（7,10,26） 。 典型豬瘟，無論豬齡大小，易感豬一旦受豬瘟強毒感染，即呈典型急 性或亞急性熱性傳染病。由口腔感染後，經二至四天潛伏期即發生熱 反應（攝氏 41 至 42 度），熱反應可持續四至六天，稱為稽留熱。 隨即發生淋巴球減少症，白血球之減少，中性球呈核左轉等現象。厭 食、皮膚充出血、結膜炎、鼻腔分泌物增加，或下血痢便，甚至後軀 痳痺和抽搐。患豬通常於二週內斃死，死亡率可高達 90 ％以上。典 型豬瘟肉眼病變主為全身性脈管炎和淋巴球的破壞，包括廣泛性漿膜 和粘膜下層的出血、血栓、脾梗塞和腸潰瘍以及淋巴結的周邊性出血 。組織病變，除甚急性斃死豬外一般可見腦炎病變（13, 42）。腦炎 是豬瘟特徵之一，以淋巴球為主的圍管現象，內皮細胞腫脹或增生和 小神經膠質細胞過多為主徵（8,14, 21）。約有 75 ％至 90 ％豬瘟 病例會有圍管性非化膿性腦炎發生（3,15,16,17）。 慢性豬瘟，特徵為早期呈急性感染，嗣後一段期間呈不完全性恢復， 最後再度復發死亡（34）。慢性豬瘟與持續性病毒血症以及免疫機能 受損有關，在腎臟和其他臟器可見免疫複合物的沈積，結腸和盲腸常 見纖維素性病變，肺臟呈出血性纖維素性肺炎，淋巴結可見淋巴球和 生發濾泡（germinal follicle） 的衰竭現象，以及玻璃樣絲球性腎 臟之免疫病理過程（12）。 非典型豬瘟或輕微型豬瘟，主要發生於豬瘟流行地區。臨床上主要見 於幼齡豬隻，有熱反應、厭食、發育受阻等症狀，偶而亦有後軀痳痺 和抽搐的神經症狀。部份非典型豬瘟症狀不明顯，病理上亦僅限於腎 臟表面，膀胱和直腸粘膜的輕微出血病變，但若健康易感豬與此症狀 不明顯之感染豬接觸，則會呈現急性豬瘟病徵（7,31）。 易感懷孕母豬，在感染毒力較低之豬瘟病毒後，此種帶毒母豬雖無臨 床症狀顯現，卻可造成子宮內胎兒的感染。Young 最先發現馴化豬瘟 活毒疫苗對胎兒的影響，懷孕 30 天內母豬接種未完全馴化之活毒疫 苗，結果初生仔豬可見胸水、腹水和局部性或全身性水腫現象（48） 。此種胎盤感染，在自然感染低毒力豬瘟病毒的懷孕母豬也有同樣結 果。子宮內胎兒感染會引起流產、死產、木乃伊化和出生時的死亡或 小豬出生時縱未死亡亦常呈衰弱和先天性震顫、外八字腳及活力減低 等症狀（6, 9, 20, 40, 44, 45）。 胎兒在子宮內感染較低毒力豬瘟病毒的結果與母豬懷孕階段有關（22 , 44）。母豬在懷孕期間感染豬瘟病毒，其仔豬往往有免疫耐受性， 無抗體產生而呈持續性帶毒狀態，這些豬雖從母豬攝取初乳移行抗體 ，但因持續性病毒作用結果而使移行抗體無法測出（35, 38, 46）。 此種小豬的先天性病毒血症可持續終生。Frey 等證實在懷孕 70 天 內受豬瘟病毒感染的胎兒，會產生免疫耐受性和持續性病毒血症（18 ）。但胎兒於免疫機能發生後，經子宮感染結果亦有免疫耐受性和持 續性病毒血症現象（47）。毒力較低之豬瘟病毒引起胎兒病變，除與 母豬之懷孕階段有關外，亦與母豬個體及胎次有關。 貳、實驗室檢驗 因豬獲得免疫狀況的不同及病毒毒力的差異，豬瘟臨床和病理上差異 也極大。因此，正確診斷需賴各項檢驗的配合。由田間疫情、臨床症 狀、肉眼和組織病理學檢查結果只能懷疑為豬瘟，必須再進行豬瘟病 毒檢測或血清豬瘟中和抗體測定才能確診。豬瘟病毒檢測適用於發病 豬隻，而血清豬瘟中和抗體測定，只適用於未曾施打豬瘟疫苗之豬隻 。 <p />一、豬瘟病毒檢測 <br />（一）冷凍切片螢光標示抗體染色法（25, 37） 1.將採得臟器組織塊切成約長 1 公分、寬 0.5 公分、厚約 0.3 公分之組織塊以包埋液包埋病材，先以低溫快速冷凍後，並以水 黏附於標本座上。 2.將組織塊置於攝氏零下 20 度冷凍 30 分鐘後以冷凍切片機，切 成厚約四至八微米（）之薄片，並以玻片取下組織薄片。 3.玻片標本以吹風機急速於室溫吹乾，並以保存在攝氏零下 20 度 丙酮於冷藏狀態下固定十分鐘後，浸泡於 0.01 莫耳磷酸鹽緩衝 液（0.01 M PBS）中，上下振動玻片以除去固定液。 4.在組織片上滴上經適當稀釋之豬瘟螢光標示抗體 0.1 毫升（ml ），置於攝氏 37 度感作 30 分鐘後以 0.01 莫耳磷酸鹽緩衝液 清洗三次，去除未作用螢光標示抗體。 5.滴上一滴甘油磷酸緩衝液（0.01 莫耳磷酸鹽緩衝液與甘油等量 混合），以蓋玻片覆蓋標本並除去多餘液體後，於螢光顯微鏡下 觀察有無豬瘟特異性螢光。 6.判定：陽性感染豬之豬瘟特異性螢光出現於感染細胞質內；而陰 性豬隻則無特異性螢光產生，宜再實施病毒分離或聚合脢鏈反應 檢測。 <br />（二）細胞培養直接螢光標示抗體染色法（1,11,33） 1.PK-15 或其他豬隻來源株化細胞，於 75 平方公分面之細胞培養 瓶長滿後，將細胞生長液倒出，並於每支細胞培養瓶加入 5 至 10 毫升溫細胞消化液沖洗一次。如此，重複沖洗二次。第二次 倒出細胞消化液時，留少許細胞消化液於瓶內。將細胞培養瓶放 置攝氏 37 度消化 3 分鐘，或直至細胞脫落後，以原細胞培養 瓶生長液三倍量之含 10 ％胎牛血清的細胞生長液沖散細胞（通 常一支培養瓶用 30 毫升 ） ，作成細胞懸浮液。於二十四孔細 胞培養盤，每孔加入一毫升細胞懸浮液，放置攝氏 37 度、含 5 ％二氧化碳之濕性培養箱內培養二天。 2.以含 2 ％胎牛血清十倍抗生素之 MEM，做成 10 ％之脾臟、淋 巴結、扁桃腺等檢體乳劑，經攝氏 4 度，1,000g 離心 30 分 鐘後取上清液。 3.將二十四孔細胞培養盤培養二天之 PK-15 細胞或其他豬隻來源 株化細胞，經滅菌 0.01 莫耳磷酸鹽緩衝液洗過後，每孔分別接 種入 0.5 毫升上述臟器乳劑上清液，每樣病材接種兩孔。另留 四孔，兩孔各接入 0.5 毫升細胞維持液作為正常細胞對照；而 其他兩孔則各接入 0.5 毫升已知豬瘟病毒液作為陽性標準對照 。放置於攝氏 37 度、含 5 ％二氧化碳之濕性培養箱內感作 4 0 分鐘，感作期間每隔 10 分鐘輕搖一次。 4.除接種細胞維持液者外，其餘各孔將接種液抽去並以滅菌 0.01 莫耳磷酸鹽緩衝液清洗細胞面三次。再於每孔加入 1 毫升含 2 ％胎牛血清之細胞維持液，然後放置於攝氏 37 度、含 5 ％二 氧化碳之濕性培養箱內培養 48 小時。 5.抽去培養液並以 0.01 莫耳磷酸鹽緩衝液清洗細胞面一次後，以 吹風器吹乾。於每孔加入一毫升美製中性福馬林，在室溫中固定 20 分鐘，再以 0.01 莫耳磷酸鹽緩衝液清洗三次，以除去固定 液。 6.於每孔加入經適當稀釋之豬瘟螢光標示抗體 0.5 毫升，攝氏 3 7 度感作 30 分鐘後以 0.01 莫耳磷酸鹽緩衝液清洗三次，去除 未作用螢光標示抗體。 7.於每孔加入 0.3 毫升甘油磷酸緩衝液後，於倒立螢光顯微鏡下 觀察有無豬瘟特異性螢光。 8.判定：接種已知豬瘟病毒液之陽性標準對照，其感染細胞之細胞 質內會呈現豬瘟特異性螢光；而接入細胞維持液之正常細胞對照 則無特異性螢光產生。接種病材乳劑上清液之細胞，若與陽性標 準對照相同可見豬瘟特異性螢光，係屬豬瘟感染豬；若與正常細 胞對照一樣無特異性螢光產生，則為豬瘟陰性。 <br />（三）細胞培養間接螢光標示抗體染色法（39） 1.PK-15 或其他豬隻來源株化細胞，於 75 平方公分面之細胞培養 瓶長滿後，將細胞生長液倒出，並於每支細胞培養瓶加入 5 至 10 毫升溫細胞消化液沖洗一次。如此，重複沖洗二次。第二次 倒出細胞消化液時，留少許細胞消化液於瓶內。將細胞培養瓶放 置攝氏 37 度消化 3 分鐘，或直至細胞脫落後以原細胞培養瓶 生長液三倍量之含 10 ％胎牛血清的細胞生長液沖散細胞（通常 一支培養瓶用 30 毫升 ） ，作成細胞懸浮液。於二十四孔細胞 培養盤，每孔加入一毫升細胞懸浮液，放置於攝氏 37 度、含 5 ％二氧化碳之濕性培養箱內培養二天。 2.以含 2 ％胎牛血清十倍抗生素之 MEM，做成 10 ％之脾臟、淋 巴結、扁桃腺等檢體乳劑，經攝氏 1 度，1,000g 離心 30 分 鐘後取上清液。 3.將二十四孔細胞培養盤培養二天之 PK-15 細胞或其他豬隻來源 株化細胞，經滅菌 0.01 莫耳磷酸鹽緩衝液洗過後，每孔分別接 種入 0.5 毫升上述臟器乳劑上清液，每樣病材接種二孔。另外 四孔，二孔各接入 0.5 毫升細胞維持液作為正常細胞對照；而 其他二孔則各接入 0.5 毫升已知豬瘟病毒液作為陽性標準對照 。放置於攝氏 37 度、含 5 ％二氧化碳之濕性培養箱內感作 4 0 分鐘，感作期間每隔 10 分鐘輕搖一次。 4.除接種細胞維持液者外，其餘各孔將接種液抽去並以滅菌 0.01 莫耳磷酸鹽緩衝液清洗細胞面三次。再於每孔加入 1 毫升含 2 ％胎牛血清之細胞維持液，然後放置於攝氏 37 度、含 5 ％二 氧化碳之濕性培養箱內培養 48 小時。 5.抽去培養液並以 0.01 莫耳磷酸鹽緩衝液清洗細胞面一次後，以 吹風器吹乾。於每孔加入 1 毫升美製中性福馬林，在室溫中固 定 20 分鐘，再以 0.01 莫耳磷酸鹽緩衝液清洗三次，以除去固 定液。 6.於每孔加入經適當稀釋之豬隻抗豬瘟病毒抗血清 0.5 毫升，置 於攝氏 37 度，感作 30 分鐘後以 0.01 莫耳磷酸鹽緩衝液清洗 三次，去除未作用抗體。 7.於每孔加入經適當稀釋之山羊抗豬免疫球蛋白Ｇ（IgG） 螢光標 示抗體 0.5 毫升，置於攝氏 37 度感作 30 分鐘後以 0.01 莫 耳磷酸鹽緩衝液清洗三次，去除未作用螢光標示抗體。 8.於每孔加入 0.3 毫升甘油磷酸緩衝液後，於倒立螢光顯微鏡下 觀察有無豬瘟特異性螢光。 9.判定：接種已知豬瘟病毒液之陽性標準對照其感染細胞之細胞質 內會呈現豬瘟特異性螢光；而接入細胞維持液之正常細胞對照則 無特異性螢光產生。接種病材乳劑上清液之細胞，若與陽性標準 對照相同可見豬瘟特異性螢光，係屬豬瘟感染豬；若與正常細胞 對照一樣無特異性螢光產生，則為豬瘟陰性。 <br />（四）豬瘟聚合脢鏈反應（PCR） 檢測 1.豬瘟病毒核酸的萃取：抽取病材乳劑上清液或細胞培養病毒液 2 00 微升（ul）放入 1.5 毫升微量試管（microtube） 內，同 時加入 GTC buffer 500 微升，混合均勻後，再加入 3 莫耳醋 酸鈉液（sodium acetate）50 微升，混合均勻後，以 500 微 升酚（phenol）萃取核酸，振盪搖勻五分鐘後，加入 CI 溶液（ chloroform:isoamylalcohol = 24:1）150 微升，搖勻後，冰浴 15 至 20 分鐘。經每分鐘 12,000 轉離心 1 至 5 分鐘後， 取出上層水溶液，並加入等體積量的異丙醇（isopropanol） ， 搖勻後，置於攝氏零下 20 度冰箱沉澱核酸二小時，再以每分鐘 12,000 轉離心 20 分鐘後去上清液。沉澱物經 70 ％乙醇 500 微升清洗乾燥後，溶於 100 微升經 0.1％DEPC 處理過的蒸餾 水，保存於攝氏零下 20 度備用。 2.反轉錄聚合脢鏈反應（reverse transcriptase polymerase chain reaction; RT-PCR）：上述萃取好的 RNA 核酸先於攝氏 70 度加熱處理 3 分鐘後立刻置於冰浴靜置 2 分鐘。經每分 鐘 12,000 轉離心 5 秒鐘後，取 20 微升 RNA 至預先混合好 的 0.65 毫升微量試管。微量試管內混合物成份如下： ┌──────────────────┬───────┐ │0.5ug/ul primer（reversed） P97R3 │ 1 l│ ├──────────────────┼───────┤ │1.25mM dNTP │ 8 l│ ├──────────────────┼───────┤ │10X Taq buffer │ 10 l│ └──────────────────┴───────┘ 再加入 RNAsin 1 單位及 AMV RTase 0.6 單位後，置於攝氏 4 2 度水浴，作用 30 分鐘，以合成第一股的 cDNA 。反應結束後 繼續加入： ┌──────────────────┬───────┐ │0.5ug/ul primer（forward） P97F3 │ 1 l│ ├──────────────────┼───────┤ │1.25mM dNTP │ 8 l│ └──────────────────┴───────┘ 以 DDW 補至總體積 100 微升於加入一單位之 Taq polymera- se 後，覆以一滴礦物油，直接放入溫度控制器內行聚合鏈反 應。反應條件如下：攝氏 94 度，1 分鐘；50 度，1 分鐘；72 度，1.5 分鐘；32 個循環數；再於 72 度延展 4 分鐘。 3.反應產物於一倍 TAE 緩衝液行 2 ％洋菜膠電泳分析，經溴化 醯液（ethidium bromide）染色後紫外線下觀察照像。 4.判定：檢驗病材若有四一五鹽基對（415bp） 長的條紋（band） 產生，而陰性對照組無時，即為豬瘟陽性反應；若檢驗病材與陰 性對照組一樣均無條紋產生則為豬瘟陰性反應。 <p />二、豬瘟中和抗體測定（END Method）（27, 29, 30） 1.中和試驗係以九十六孔微量塑膠培養盤進行試驗，以 0.05 毫升細 胞生長液作為稀釋液並加等量血清進行二倍連續稀釋。 2.稀釋後之血清再加入等量的 A76 豬瘟病毒液（100 TCID50），培 養盤在震盪器上充份震盪後放置於攝氏 37 度、含 5 ％二氧化碳 之溼性培養箱內感作一小時。 3.感作後每孔再加入 0.1 毫升之初代豬睪丸細胞液（4 x 105 個細 胞），然後放置在攝氏 37 度、含 5 ％二氧化碳之溼性培養箱內 培養四天。 4.經吸去培養液後，每孔加入以細胞生長液適當稀釋的宮寺株新城雞 病病毒液（1 ＨＡ單位）0.1 毫升攻擊。再放置於攝氏 37 度、含 5 ％二氧化碳之溼性培養箱內培養。 5.試驗中同時設立豬瘟陽性和陰性血清、豬瘟病毒、豬瘟與新城雞病 病毒、新城雞病病毒以及正常細胞等對照組。標準陽性及陰性血清 與預測血清的處理方法同。 6.每天觀察細胞情形並以第三天為最終判讀。 7.判讀時，若檢驗量過多而不便使用顯微鏡觀察，則可用 0.5％ 結 晶紫甲醇溶液固定染色 10 分鐘，以自來水沖洗乾淨後觀察之。 8.判讀時，無細胞病變（CPE） 即為抗體陽性反應，代表血清中有豬 瘟抗體。若判讀有細胞病變即為抗體陰性反應，代表血清中無豬瘟 抗體。豬隻血清中含有豬瘟中和抗體代表該豬隻曾經感染豬瘟病毒 或曾經接種過豬瘟疫苗。 參、各項檢驗之材料與技術：如附錄一 。 肆、參考文獻：如附錄二